土壤幾丁質(zhì)酶試劑盒說明書

更新時間：2024-05-14

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土壤幾丁質(zhì)酶試劑盒說明書

**注意：正式測定之前選擇2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。**

貨號：DM-W-B917

規(guī)格：100 管/48 樣

緩沖液：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存，使用前搖勻。試劑二：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1 瓶。5mg N-乙酰氨基葡萄糖，4℃保存。臨用前加入 2.27mL 蒸餾水配成10μmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

幾丁質(zhì)主要存在于蝦、蟹、昆蟲等甲殼類動物的外殼與軟體動物的器官(例如烏賊的軟骨)，以及真菌類的細(xì)胞壁中，而幾丁質(zhì)酶(EC 3.2.1.14)可催化幾丁質(zhì)水解，具有抵御真菌侵染的作用，成為抗真菌病害的研究熱點(diǎn)。

幾丁質(zhì)酶水解幾丁質(zhì)產(chǎn)生N-乙酰氨基葡萄糖，進(jìn)一步與 3,5-二硝基水楊酸產(chǎn)生棕紅色化合物，在540nm 處有特征吸收峰，吸收值增加速率反映了幾丁質(zhì)酶的活性。

天平、水浴鍋、離心機(jī)、震蕩儀、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板，甲苯、蒸餾水。

1、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min。波長調(diào)至 540nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為 5、4、3、2、1μmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

3、在 EP 管中分別加入：

試劑名稱	測定管	對照管	標(biāo)準(zhǔn)管	空白管
土樣(g)	0.02	0.02	-	-
甲苯（μL）	10	10	-	-
緩沖液（μL）	120	40	-	-
試劑一（μL）	-	80	-	-
混勻，37℃震蕩培養(yǎng)1h，8000rpm，4℃，離心10min，取上清100μL，再加入下列試劑
蒸餾水（μL）	-	-	-	100
上清液（μL）	100	100
標(biāo)準(zhǔn)溶液（μL）		-	100

試劑二

蒸餾水

100

混勻，沸水浴10min，立即置于冰上至室溫。取 200μL 于微量石英比色皿/96 孔板中，測定

540nm 處吸光值，記為A 測定管、A 對照管、A 標(biāo)準(zhǔn)管、A 空白管。計(jì)算ΔA 測定=A 測定管-

A 對照管，ΔA 標(biāo)準(zhǔn)=A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管。

三、計(jì)算公式

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：以濃度（y）為縱坐標(biāo)，ΔA 標(biāo)準(zhǔn)（x）為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以ΔA 標(biāo)準(zhǔn)為 y 軸，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為 x 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程 y=kx+b。將ΔA 測定帶入標(biāo)準(zhǔn)方程中，得到 x（μmol/mL）

酶活性定義：37℃條件下，每克土壤每天分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活性單位。

幾丁質(zhì)酶活力（U /g 土樣）＝ y×V 反總÷W÷T =3.12×y÷W

T：反應(yīng)時間，1/24d； V 反總：反應(yīng)體系總體積：0.13mL；W：樣品質(zhì)量，0.02g。