查找:單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)測試盒

MDHAR催化MDHA還原生成AsA,在抗壞血酸氧化還原代謝中具有重要作用。

MDHAR催化NADH還原MDHA生成AsA和NAD+,NADH在340nm有特征吸收峰,但是NAD+沒有。通過測定340nm光吸收下降速率,來計算出MDHAR活性。

注意:實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

產(chǎn)品內(nèi)容:

試劑名稱             規(guī)格                 保存條件
提取液       液體60ml×1瓶              4℃
試劑一       液體30ml×1瓶              4℃
試劑二          粉劑×1瓶                   4℃
試劑三          粉劑×1瓶                -20℃
試劑四          液體×1瓶                -20℃
溶液的配制:

1.試劑二:臨用前加入5ml蒸餾水充分溶解,4℃保存;

2.試劑三:臨用前加入5ml蒸餾水充分溶解,可溶解后分裝-20℃保存,避免反復(fù)凍融;

3.試劑四:液體置于試劑瓶內(nèi)EP管中。臨用前加5ml試劑一充分溶解,可溶解后分裝-20℃保存,避免反復(fù)凍融。

需自備的儀器和用品:

研缽/勻漿器、冰、臺式離心機(jī)、紫外分光光度計、1ml石英比色皿、可調(diào)式移液槍和雙蒸水。

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操作步驟:

一、樣本處理理(可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))

1.組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(ml)1:5-10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1ml提取液)進(jìn)行冰浴勻漿。10000rpm,4℃離心10min,取上清置冰上待測。

2.細(xì)菌、細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(ml)為500-1000:1的比例(建議500萬細(xì)胞加入1ml提取液),冰浴超聲破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3s,間隔7s,總時間3min);然后10000rpm,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。

二、測定步驟

1.分光光度計預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長到340nm,蒸餾水調(diào)零。

2.試劑一在25℃水浴鍋中預(yù)熱30min。

3.依次在石英比色皿中加入下列試劑

試劑名稱(μL)            空白管            測定管
試劑二                       100                100
試劑三                       100                100
試劑四                       100                100
試劑一                       400                400
蒸餾水                       300
上清液                                             300
迅速混勻后于340nm比色,記錄30s和150s的吸光值。分別記為A1、A2,ΔA=A1-A2,得到ΔA測定管、ΔA空白管。

三、MDHAR活性計算:

1.按蛋白濃度計算

MDHAR活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmol NADH為一個酶活單位。

MDHAR (U/mg prot) =[(ΔA測定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反總×106]÷(Cpr×V樣)÷T=0.268×(ΔA測定管-ΔA空白管)÷Cpr

2.按樣本質(zhì)量計算

MDHAR活性單位定義:25℃中每克樣本每分鐘氧化1μmol NADH為一個酶活單位。

MDHAR (U/g質(zhì)量) =[(ΔA測定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反總×106]÷(V樣÷V樣總×W)÷T=0.268×(ΔA測定管-ΔA空白管)÷W

3.按細(xì)胞數(shù)量計算

MDHAR活性單位定義:25℃中每104個細(xì)胞每分鐘氧化1μmol NADH為一個酶活單位。

MDHAR (U/104cell) =[ (ΔA測定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反總×106]÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T=0.268×(ΔA測定管-ΔA空白管)÷細(xì)胞數(shù)量

ε:NADH摩爾消光系數(shù),6220 L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;106:單位換算系數(shù),1mol=1×106μmol;V反總:反應(yīng)體系總體積,1ml=0.001L;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,300μL=0.3ml;V樣總:提取液體積,1ml;Cpr:上清液蛋白濃度,mg/ml,蛋白質(zhì)濃度需要另外測定;W:樣本質(zhì)量,g;細(xì)胞數(shù)量:以104為單位計量,萬個;T:反應(yīng)時間,2min。

注意事項:

1.當(dāng)ΔA測定大于0.3時,建議客戶稀釋樣本或者調(diào)整試劑一和上清液的比例(如將400μL試劑一+300μL上清液改為600μL試劑一+100μL上清液)后進(jìn)行測定。

2.當(dāng)ΔA測定過小時,建議客戶提高樣本量或者調(diào)整試劑一和上清液的比例(如將400μL試劑一+300μL上清液改為 200μL試劑一+500μL上清液)。

3.當(dāng)A1大于1.5時,建議將樣本稀釋進(jìn)行測定。

4.空白管為檢測各管試劑組份的檢測孔,正常情況下,其OD值在0.5左右,變化不超過0.01。

5.由于提取液中含有一定濃度的蛋白(約1mg/ml),所以在測定樣品蛋白濃度時需要減去提取液本身的蛋白含量。