猴閉鎖蛋白/遮光蛋白(OCLN)酶聯(lián)免疫試劑盒  

實驗原理

酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一種常用的免疫學檢測技術，其基本原理是利用抗原與抗體之間的特異性結合反應，通過酶促反應放大信號，檢測微量的蛋白質、細胞因子等生物活性物質。ELISA實驗中所需的試劑和耗材需滿足一定的質量要求，以保證實驗結果的準確性和可靠性。

檢測前準備工作:

1. 請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶，屬于正常現(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結晶溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過50℃，使用時洗滌液應為室溫）。當日使用。

3. 標準品: 于10000×g離心1分鐘，加入標準品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標準品中，旋緊管蓋，靜置10分鐘，上下顛倒數(shù)次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為8000pg/mL）。然后根據(jù)需要進行倍比稀釋（注：不要直接在反應孔中進行倍比稀釋）。建議配制成以下濃度：按照稀釋方法圖例 標準品&樣品稀釋液直接作為空白孔0ng/mL。如配制5ng/mL標準品：取0.5mL10ng/mL的上述標準品加入含有0.5mL標準品&樣品稀釋液的EP管中，混勻即可，其余濃度依此類推。 

4. 生物su化抗體工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配制100-200μL。使用前15分鐘，以生物su化抗體稀釋液稀釋濃縮生物su化抗體(1:100)成工作濃度。當日使用。

5. 酶結合物工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配制100-200μL。使用前15分鐘，以酶結合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結合物(1:100)成工作濃度。

當日使用。

猴閉鎖蛋白/遮光蛋白(OCLN)酶聯(lián)免疫試劑盒

操作步驟：

1. 加樣：設置空白孔、標準孔和待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl。注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。每次實驗都應制作標準曲線。如果樣品濃度過高，可以用樣品稀釋液進行稀釋，使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物su標記抗體工作液 100μl（取1μl生物su標記抗體加99μl生物su標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制），37℃,60分鐘。溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

3. 每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物su標記抗體工作液） 100μl，37℃，60分鐘。溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

4. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

5. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。

6. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15分鐘以內進行檢測。

結果判斷:

1. 每個標準品的OD值減去空白孔的OD值后作圖，如設置復孔，則應取其平均值計算。以標準品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出標準曲線。亦可以OD值為橫坐標，標準品的濃度為縱坐標，繪出標準曲線。

2. 推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件，如curve expert 1.3或1.4，在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值，由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；亦可將樣品的OD值代入標準曲線的擬合方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

3. 若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)。 

實驗注意事項

1. 抗原和抗體的儲存：應嚴格按照說明書要求存放抗原和抗體，避免反復凍融和長時間暴露在高溫環(huán)境中。同時要保證試劑盒未過期，以獲得可靠的實驗結果。

2. 加樣技術：加樣時應保證加入的體積準確且不產生氣泡，避免加在孔壁的邊緣，以免影響與固相表面的接觸。加樣時應在每孔的旁邊放置一個加樣對照孔，以監(jiān)測加樣的準確性和重復性。

3. 溫育：溫育是ELISA實驗中的重要步驟，溫育時間和溫度的控制對于抗原抗體反應的進行和結果的影響至關重要。必須嚴格按照說明書要求進行溫育，并注意保持恒溫狀態(tài)。

4. 洗滌：洗滌是ELISA實驗中的一步，它可以去除未結合的物質，提高檢測的特異性和靈敏度。洗滌時應保證每次洗滌時間充足，并更換洗滌液以保證洗滌效果。同時要避免在洗滌過程中產生氣泡，以免影響洗滌效果。

樣品收集、處理及保存方法

1. 血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000 轉離心 10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉離心 30 分鐘取上清。

3. 細胞上清液：3000 轉離心 10 分鐘去除顆粒和聚合物。

4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉離心 10 分鐘取上清。

5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解 凍并確保樣品均勻地充分解凍。

什么時候進行ELISA測試時需要準備一系列稀釋樣本?

1)未知樣本濃度:當你不知道樣本中抗原或抗體的濃度時，準備一系列稀釋樣

可以幫助確保至少有一些稀釋度落在ELISA的線性檢測范圍內。

2)避免信號飽和:對于濃度較高的樣本，稀釋可以防止信號飽和，即吸光度值超

出光度計的最大讀數(shù)，從而保證結果的線性和準確性。

3)減少高劑量掛鉤效應:在某些情況下，過高的抗原濃度會導致檢測抗體無法形

成“夾心"結構，反而降低了檢測信號，這稱為“掛鉤效應"。稀釋樣本可以避免這一

現(xiàn)象。

4)優(yōu)化檢測條件:為了找到最佳的檢測條件和稀釋度，初步實驗通常會涵蓋廣泛

的稀釋范圍，以便后續(xù)實驗可以直接使用最佳稀釋度。

5)建立標準曲線:對于定量ELISA，需要使用一系列已知濃度的標準品來建立標準

曲線，未知樣本的結果將與此曲線比較以確定其濃度。

6)控制非特異性結合:稀釋樣本可以減少非特異性結合，這種結合可能在高濃度

樣本中更為常見。

7)實驗重復性和可比性:為了確保實驗的重復性和可比性，對于不同時間點或不

同實驗條件下的樣本，通常需要準備相同的稀釋系列。

8)特殊樣本類型處理:某些樣本類型(如血清、血漿或含有抑制劑的樣本)可能

需要稀釋以減少背景干擾或抑制劑的影響。

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