豬轉錄激活因子-5(ATF-5) ELISA 試劑盒  

僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!

產品規(guī)格：96T/48T（可拆）

產品數(shù)量：咨詢

產品應用：ELISA實驗

產品貨期：現(xiàn)貨

有效期：6個月

保存條件：2-8℃

豬轉錄激活因子-5(ATF-5) ELISA 試劑盒 

實驗原理

酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一種基于抗原抗體反應的免疫學檢測方法。其基本原理是利用抗原抗體的特異性結合，通過酶對底物反應的顯色反應，對樣本中的待測物質進行定量或定性分析。ELISA方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、適用范圍廣等特點，因此在生物醫(yī)學研究、臨床診斷和食品安全檢測等領域得到了廣泛應用。

樣品收集、處理及保存方法

1. 血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000 轉離心 10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉離心 30 分鐘取上清。

3. 細胞上清液：3000 轉離心 10 分鐘去除顆粒和聚合物。

4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉離心 10 分鐘取上清。

5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解 凍并確保樣品均勻地充分解凍。

標本的稀釋原則：

首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標準曲線的范圍內，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中，應做好詳細的記錄。計算濃度時，稀釋了“N"倍，標本的濃度應再乘以“N"。 

標準品的稀釋原則：

2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為300 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋300 pg/ml，150 pg/ml，75 pg/ml，37.5 pg/ml，18.5 pg/ml，9 pg/ml，4.5 pg/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內配制。 如配制150 pg/ml標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）300 pg/ml的上述標準品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。 

生物su標記抗體的稀釋原則：

臨用前以生物su標記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl生物su標記抗體加990μl生物su標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。 

辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：

臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標記親和素加990μl辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。

實驗步驟

1. 抗原包被：將抗原溶液加入到酶標板孔中，包被抗原，使其在孔底形成一層薄膜。

2. 清洗：清洗酶標板，去除未結合的抗原和其他雜質。

3. 阻斷：加入阻斷液，封閉酶標板孔中的非特異性結合位點，以減少非特異性結合。

4. 清洗：清洗酶標板，去除未結合的阻斷液和其他雜質。

5. 加樣：加入待測樣本，使其與抗原發(fā)生特異性結合。

6. 清洗：清洗酶標板，去除未結合的樣本和其他雜質。

7. 加酶標抗體：加入酶標記的抗體，使其與特異性結合的樣本中的待測物質發(fā)生反應。

8. 清洗：清洗酶標板，去除未結合的酶標抗體和其他雜質。

9. 顯色反應：加入底物溶液，發(fā)生酶催化反應，產生有色產物。

10. 終止反應：加入終止液，停止酶催化反應。

11. 檢測：用酶標儀測定各孔的光密度值，記錄數(shù)據(jù)。

ELISA試劑盒實驗數(shù)據(jù)的計算處理方法

1、擬和曲線：

輸入第一行： 濃度值， 如0 10 50 100 400

輸入第二行：該濃度下的調整后的od值，如0 0.586 1.397 1.997 3.42

選擇這些輸入的數(shù)據(jù)，用插入里的圖表按鈕，進入圖表向導，在“標準類型"中選擇“xy散點圖";在“子圖表類型"中選擇“折線散點圖"，按“下一步";選擇“系列產生在行"，按“下一步";數(shù)據(jù)標志，可以填寫：如數(shù)據(jù)y軸，OD值;數(shù)據(jù)x軸，濃度;按下一步，點擊完成。可得曲線圖。

單擊曲線，按右鍵，選擇“添加趨勢線"，在類型中，選擇多項式;在選項中，選擇顯示公式，選擇顯示R平方值。

得到公式和R平方值。

也可以用上面說的方法： 雙擊圖表，把它輸入到圖表的數(shù)據(jù)中，就可以擬和曲線。

2、計算濃度：

第一次實驗：

標準曲線為：

y = -4E-05x2 + 0.026x

R2 = 0.9745

為例，已知OD值，計算濃度。

由于y = -4E-05x2 + 0.026x，可以得到：

4E-05x2 -0.026x +y=0

ax2 +bx +y=0

注意事項

1. 實驗前請仔細閱讀本試劑盒的使用說明，確保所有材料、器具和試劑準備齊全。

2. 為保證實驗結果的準確性，請務必遵循實驗步驟進行操作，并注意控制實驗條件的一致性。

3. 實驗過程中請勿觸摸酶標板上的酶標抗體區(qū)域，以免影響實驗結果。

4. 實驗結束后請及時清洗并整理實驗器具，避免交叉污染。

5. 本試劑盒僅供體外診斷使用，使用前請仔細閱讀說明書，如有疑問請及時聯(lián)系廠家或專業(yè)技術人員。

結果判斷

 繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

什么時候進行ELISA測試時需要準備一系列稀釋樣本?

1)未知樣本濃度:當你不知道樣本中抗原或抗體的濃度時，準備一系列稀釋樣

可以幫助確保至少有一些稀釋度落在ELISA的線性檢測范圍內。

2)避免信號飽和:對于濃度較高的樣本，稀釋可以防止信號飽和，即吸光度值超

出光度計的最大讀數(shù)，從而保證結果的線性和準確性。

3)減少高劑量掛鉤效應:在某些情況下，過高的抗原濃度會導致檢測抗體無法形

成“夾心"結構，反而降低了檢測信號，這稱為“掛鉤效應"。稀釋樣本可以避免這一

現(xiàn)象。

4)優(yōu)化檢測條件:為了找到最佳的檢測條件和稀釋度，初步實驗通常會涵蓋廣泛

的稀釋范圍，以便后續(xù)實驗可以直接使用最佳稀釋度。

5)建立標準曲線:對于定量ELISA，需要使用一系列已知濃度的標準品來建立標準

曲線，未知樣本的結果將與此曲線比較以確定其濃度。

6)控制非特異性結合:稀釋樣本可以減少非特異性結合，這種結合可能在高濃度

樣本中更為常見。

7)實驗重復性和可比性:為了確保實驗的重復性和可比性，對于不同時間點或不

同實驗條件下的樣本，通常需要準備相同的稀釋系列。

8)特殊樣本類型處理:某些樣本類型(如血清、血漿或含有抑制劑的樣本)可能

需要稀釋以減少背景干擾或抑制劑的影響。

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