綿羊蛋白酶激活受體4(PAR4) ELISA 試劑盒

ELISA的樣本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
在收集樣本前都必須有一個(gè)完整的計(jì)劃，必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。對收集后當(dāng)天就進(jìn)行檢測的樣本，及時(shí)儲存在4℃?zhèn)溆谩τ诟籼煸贆z測的樣本，及時(shí)分裝后凍存在-20℃?zhèn)溆?，有條件的可在-70℃凍存?zhèn)溆?。?biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融。

液體類標(biāo)本:  包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細(xì)胞培養(yǎng)上清等。

1. 血清：
室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

2. 血漿：
應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

3. 尿液：
用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實(shí)行。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：
檢測分泌性的成份時(shí)，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。

5. 培養(yǎng)細(xì)胞
    檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融或加入組織蛋白萃取試劑，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

6. 組織標(biāo)本
切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），或組織蛋白萃取試劑, 用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿化。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。  
 



實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1. 抗原和抗體的儲存

應(yīng)嚴(yán)格按照說明書要求存放抗原和抗體，避免反復(fù)凍融和長時(shí)間暴露在高溫環(huán)境中。同時(shí)要確認(rèn)試劑盒未過期，以獲得可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1. 加樣技術(shù)

加樣時(shí)應(yīng)確認(rèn)加入的體積準(zhǔn)確且不產(chǎn)生氣泡，避免加在孔壁的邊緣，以免影響與固相表面的接觸。加樣時(shí)應(yīng)在每孔的旁邊放置一個(gè)加樣對照孔，以監(jiān)測加樣的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

1. 溫育

溫育是ELISA實(shí)驗(yàn)中的重要步驟，溫育時(shí)間和溫度的控制對于抗原抗體反應(yīng)的進(jìn)行和結(jié)果的影響至關(guān)重要。必須嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行溫育，并注意保持恒溫狀態(tài)。

1. 洗滌

洗滌是ELISA實(shí)驗(yàn)中的一步，它可以去除未結(jié)合的物質(zhì)，提高檢測的特異性和靈敏度。洗滌時(shí)應(yīng)確認(rèn)每次洗滌時(shí)間充足，并更換洗滌液以確認(rèn)洗滌效果。同時(shí)要避免在洗滌過程中產(chǎn)生氣泡，以免影響洗滌效果。

 
結(jié)果判斷:

1.     每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值減去空白孔的OD值后作圖，如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。亦可以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.    推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件，如curve expert 1.3或1.4，在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；亦可將樣品的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
3.  若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。
 
試劑盒 必知說明：

1）只有全部使用本試劑盒配套試劑才能確保檢測效果，

2）不能混用其他制造商的產(chǎn)品，只有嚴(yán)格遵守本試劑盒的實(shí)驗(yàn)說明才會得到好的檢測結(jié)果。

3）由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。

4）實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑盒的效果、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)。

5）請務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。

6）不同批次的同一產(chǎn)品可能會有少許差別，

如：檢測限、靈敏度以及顯色時(shí)間等，請依據(jù)試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

化學(xué)實(shí)驗(yàn)室守則：

1. 實(shí)驗(yàn)室要保持安靜，嚴(yán)禁大聲喧嘩、吵鬧。

2. 在實(shí)驗(yàn)前，要預(yù)先作好實(shí)驗(yàn)前前準(zhǔn)備，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時(shí)，要有秩序，按規(guī)定的座位就座。

3. 實(shí)驗(yàn)前，必須了解清楚實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、目的、要求和實(shí)驗(yàn)步驟。

4. 實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，應(yīng)先查點(diǎn)儀器、產(chǎn)品是否齊全，不得隨意調(diào)換，如發(fā)現(xiàn)問題，及時(shí)報(bào)告。

5. 實(shí)驗(yàn)必須按步驟進(jìn)行，并仔細(xì)觀察，做好記錄，實(shí)驗(yàn)后后及時(shí)寫好實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

6. 實(shí)驗(yàn)時(shí)，要愛護(hù)儀器，節(jié)省產(chǎn)品，由于違反操作規(guī)程而損壞丟失的儀器，必須賠償。

7. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，要將儀器整理或清洗，保持桌面，室內(nèi)的整潔后才能離開。

8. 本守則在實(shí)驗(yàn)前都應(yīng)需知。


篤瑪代測服務(wù)：
技術(shù)服務(wù)內(nèi)容
1、雙抗體夾心法檢測抗原
2、間接法檢測抗體
3、為客戶提供各種ELISA技術(shù)進(jìn)行樣本檢測。

寄標(biāo)本時(shí)需注明以下情況
1、標(biāo)本編號；
2、所測項(xiàng)目；
3、是否做復(fù)孔；
4、實(shí)驗(yàn)后標(biāo)本是否寄回。

問：代測，有什么具體要求？
樣本要處理過的，寄來的樣本附檢驗(yàn)要求（一定要附檢驗(yàn)要求）
樣本寄來要記得保存好，一定要放置冷凍冰袋

問:什么樣的檢驗(yàn)要求？要出示什么嗎？
怎樣算是處理過？還是就只是離心保存？
答：離心保存，檢驗(yàn)要求，就是標(biāo)本標(biāo)號，和特殊要求

問：測好多指標(biāo) 血清不分開可以么？
答：要分開，分好后，分別標(biāo)上序列號，便于實(shí)驗(yàn)好區(qū)分。

綿羊蛋白酶激活受體4(PAR4) ELISA 試劑盒

產(chǎn)品包裝：盒裝
性狀：瓶裝液體
規(guī)格：96T/48T
保存條件：2-8℃
保存期限：6個(gè)月
運(yùn)輸條件：2-8℃低溫運(yùn)輸，干冰低溫運(yùn)輸。
 
保存條件及保存期：
1.試劑盒保存：2-8℃。
2．保存期：6個(gè)月

試劑盒組成：

1. 酶標(biāo)板：用于包被抗原和加入酶標(biāo)抗體；

2. 酶標(biāo)抗體：與待測血清中的樣本結(jié)合；

3. 抗原：用于包被酶標(biāo)板，與待測血清中的樣本結(jié)合；

4. 陰性對照血清：用于設(shè)置陰性和陽性對照；

5. 陽性對照血清：用于設(shè)置陰性和陽性對照；

6. 洗滌液：用于清洗酶標(biāo)板；

7. 底物：用于顯色反應(yīng)；

8. 終止液：用于終止顯色反應(yīng)。

操作步驟
實(shí)驗(yàn)開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時(shí)，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1.加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。
為確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加標(biāo)記抗體工作液 100μl（取1μl標(biāo)記抗體加99μl標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37℃,60分鐘。

3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

4.每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同標(biāo)記抗體工作液） 100μl，37℃，60分鐘。

5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。



試劑盒會出現(xiàn)的問題及解決辦法：

1. 加入反應(yīng)終止液后，沒有吸光值或吸光值偏低。

a.原因：未加入酶標(biāo)記物。
解決辦法：請按照操作步驟進(jìn)行。

b.原因：試劑盒內(nèi)容物未能充分回。
解決辦法：確定試劑盒內(nèi)容物回溫后再進(jìn)行操作。

c.原因：室溫太低。
解決辦法：若室溫太低(<19℃)，請于操作步驟4，適當(dāng)延長溫育時(shí)間。

d.原因：未使用試劑盒的清洗液清洗。
解決辦法： 請用試劑盒內(nèi)所提供的清洗液清洗。

e.原因：試劑盒已過保存期限。
解決辦法：請更換成仍在保存期限內(nèi)的試劑盒。

2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性不佳，或是平行性不好。

a.原因：溫育位置避光不好或受到氣流干擾。
解決辦法： 請確認(rèn)溫育位置既不透光也不透風(fēng)(如抽屜內(nèi))。

b.原因：操作時(shí)間拖太久。
解決辦法：請?jiān)诜椒ㄊ炀毢笤龠M(jìn)行操作。

c.原因：微孔間相互污染。
解決辦法： 加樣品時(shí)，請小心勿濺出微孔外，以免造成其它微孔的污染。

d.原因：標(biāo)準(zhǔn)品或酶標(biāo)記物所加入的量不一致。
解決辦法：請使用已校正過的移液槍，并確保其與吸頭之間有高度密合性。

e.原因：添加樣品或試劑的操作方法不正確。
解決辦法：加樣品或試劑時(shí)，吸頭請勿接觸微孔。

f.原因：洗板過程發(fā)生問題(如管路堵塞、洗完板后未立刻進(jìn)行下一步驟)。
解決辦法：請隨時(shí)監(jiān)控洗板機(jī)洗板過程，洗完后立即進(jìn)行下一步驟。

3. 吸光值均偏高(或線性不夠陡)。
a.原因：室溫太高(>25℃)。
解決辦法： 若無法降低室內(nèi)溫度，請適當(dāng)縮短步驟4的溫育時(shí)間。

b.原因：底物溶液受到污染。
解決辦法： 若發(fā)現(xiàn)底物溶液已呈現(xiàn)淡藍(lán)色，請不要再使用。

c.原因：反應(yīng)時(shí)間超過太久。
解決辦法：請控制反應(yīng)時(shí)間。

d.原因：酶標(biāo)記物污染了盒內(nèi)其它試劑。
解決辦法：使用過的吸頭應(yīng)立即丟棄，可避免試劑間相互污染，凡是試劑(特別是酶標(biāo)記物與底物溶液)接觸過的容器應(yīng)立即清洗干凈。(先以漂白水浸泡，再以清水沖洗干凈，可確保無殘留)