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簡(jiǎn)要描述:綿羊骨成型蛋白1(BMP-1) ELISA 試劑盒 :質(zhì)量穩(wěn)定,準(zhǔn)確性高。篤瑪生物全程提供技術(shù)指導(dǎo),確保您實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性還提供免費(fèi)代測(cè)服務(wù)。您只需提供代測(cè)樣本,七個(gè)工作日內(nèi)即可為您提供代測(cè)數(shù)據(jù)。歡迎前來(lái)咨詢,訂購(gòu)。
試劑盒局限
6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的,根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無(wú)法得到精確的結(jié)果。
試劑盒性能
1、靈敏度:最小的檢測(cè)濃度小于1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。
2、特異性:不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)。
3、重復(fù)性高:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。
如何保證ELISA試劑盒的質(zhì)量
辦法學(xué)的影響
ELISA測(cè)定模式包含以下幾種:雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、IgM抗體捕捉法、競(jìng)賽抑制法,其中競(jìng)賽抑制法(HBeAb,HBcAb等采用)因受操作時(shí)差所引起的平競(jìng)賽等要素的影響,成果重復(fù)性較差,質(zhì)量較難控制。
第二、試劑要素
不同批次的ELISA試劑在制造進(jìn)程中很難確保質(zhì)量一致,即使是經(jīng)過(guò)批批檢的項(xiàng)目其檢測(cè)成果也存在差異,因而必須選擇和訂貨長(zhǎng)批號(hào)的試劑,并確保保存條件。嚴(yán)厲執(zhí)行這一規(guī)范可以防止因試劑批號(hào)改動(dòng)而從頭樹(shù)立質(zhì)控系統(tǒng)及從頭評(píng)估試劑的雜亂進(jìn)程,并且可以確保成果的穩(wěn)定性;對(duì)于效期短、使用率低的試劑,應(yīng)當(dāng)小量分裝,每次使用則取分裝部分即可,防止重復(fù)凍融造成試劑的失效。
第三、樣本要素
標(biāo)本攪擾要素包含內(nèi)源性攪擾要素和外源性攪擾要素,ELISA試劑盒前者包含類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、異嗜性抗體、自身抗體、等,后者包含標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本儲(chǔ)存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、標(biāo)本凝結(jié)不全、冷凍標(biāo)本的重復(fù)凍融等。
第四、操作要素
ELISA操作步驟雜亂,操作不當(dāng)將引起較大的誤差。加樣、溫育、洗滌、顯色、比色。
第五、灰區(qū)的設(shè)置
通常情況下,ELISA定性實(shí)驗(yàn)以“陽(yáng)性"和“陰性"來(lái)陳述成果,兩者間有一條分界線被稱為
“陽(yáng)性判斷值"(cut-off value,CO值),這是定性免疫測(cè)定成果陳述的依據(jù)。
第六、標(biāo)本復(fù)查
ELISA手工檢測(cè)進(jìn)程雜亂,影響要素較多,即使室內(nèi)質(zhì)控在控,也可能因孔間差異而造成成果的差異,因而加大復(fù)查力度是確保成果準(zhǔn)確性的牢靠辦法,比如對(duì)HBsAg、HBeAg、HCV-Ab、HIV-Ab、TP-Ab等項(xiàng)目的可疑、弱陽(yáng)性標(biāo)本及罕見(jiàn)模式的檢測(cè)成果進(jìn)行復(fù)查。
第七、常表明成果的常用辦法
1.定性測(cè)定
2.半定量測(cè)定 成果一般以滴度表明。
3.定量測(cè)定 即用已知量的規(guī)范品作一系列稀釋后進(jìn)行ELISA測(cè)定,制作規(guī)范曲線,成果以jue對(duì)量或單位表明。在ELISA試劑盒定量檢測(cè)中每一塊反應(yīng)板都必須制作相應(yīng)的規(guī)范曲線。
不按說(shuō)明書(shū)操作會(huì)造成的后果
每一個(gè)試劑盒里都會(huì)有對(duì)應(yīng)的說(shuō)明書(shū),注意事項(xiàng)里大多都會(huì)提到“實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行"。為什么要嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作?為了更完整的回答這個(gè)問(wèn)題,需要先回顧一下ELISA各種方法的原理。
根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的性狀及檢測(cè)的具體條件,可設(shè)計(jì)出不同類型的檢測(cè)方法。大致分為以下幾類:
1.雙抗體夾心法測(cè)抗原
2.雙抗原夾心法測(cè)抗體
3.競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原
4.間接法測(cè)抗體
總結(jié)如果不按說(shuō)明書(shū)操作可能會(huì)出現(xiàn)的不滿意結(jié)果。
A. 先說(shuō)最嚴(yán)重的操作錯(cuò)誤,看錯(cuò)或壓根不看試劑盒配套說(shuō)明書(shū),不按操作步驟加樣。比如把競(jìng)爭(zhēng)法的試劑盒當(dāng)作雙抗體夾心法來(lái)做,導(dǎo)致的結(jié)果就是整板顯示很強(qiáng)的藍(lán)色,無(wú)任何梯度。
B. 混用別的試劑盒里的試劑。不同廠家或者相同廠家的不同試劑盒,所含的試劑成分很可能是不一樣的,混用導(dǎo)致的結(jié)果是,浪費(fèi)珍貴的樣本,樣品的回收率達(dá)不到預(yù)期值,如果混用不同試劑盒的酶復(fù)合物,會(huì)導(dǎo)致顯色過(guò)弱或過(guò)強(qiáng),因?yàn)槊糠N試劑盒所用酶復(fù)合物效價(jià)可能不一樣。
C. 不看文獻(xiàn)或者不做預(yù)實(shí)驗(yàn)。比如某個(gè)試劑盒按照其靈敏度范圍和文獻(xiàn)報(bào)道推算樣本應(yīng)該1:10稀釋,結(jié)果稀釋成1:1000,導(dǎo)致的結(jié)果是顯色過(guò)弱,結(jié)果不可用。
D. 不校準(zhǔn)移液器及培養(yǎng)箱的溫度濕度。導(dǎo)致工作試劑濃度不準(zhǔn)確,孵育溫度不合適,實(shí)驗(yàn)帶來(lái)誤差。
E. 洗滌不充分,每孔洗液加樣過(guò)少,或者殘留。導(dǎo)致的結(jié)果是顯色過(guò)快,同時(shí)背景較高。
F. 手洗板時(shí)所用槍頭沒(méi)有懸空加入洗液,導(dǎo)致洗液污染,整個(gè)實(shí)驗(yàn)失敗。
G. 剩余酶標(biāo)板條未及時(shí)放入干燥袋,導(dǎo)致酶標(biāo)板受潮,下一次再做時(shí),顯色過(guò)弱或污染,CV值過(guò)高。
怎么挑選適合自己實(shí)驗(yàn)的抗體
一、關(guān)于特異性的挑選:
特異性的挑選首要需求考慮四個(gè)方面:蛋白特異性、種屬特異性、試驗(yàn)方法特異性、符號(hào)物的特異性。
1、蛋白特異性:
針對(duì)需求檢測(cè)的蛋白查找抗體,幾個(gè)細(xì)節(jié)要區(qū)分,重組表達(dá)的蛋白和內(nèi)源性蛋白的檢測(cè),對(duì)抗體的要求是不一樣的,注意檢查抗體說(shuō)明書(shū)的檢測(cè)說(shuō)明。假如重組蛋白不是全長(zhǎng)表達(dá),則需求注意抗體的免疫原區(qū)域是否在重組蛋白區(qū)域內(nèi)。
內(nèi)源性蛋白能清楚其剪切與潤(rùn)飾的方式,特殊表型的蛋白需求進(jìn)行序列比對(duì),并結(jié)合抗體免疫原序列,檢查穿插反應(yīng)的狀況。磷酸化蛋白檢測(cè)需求確認(rèn)具體位點(diǎn),不同位點(diǎn)的磷酸化意味著或許有不同的機(jī)制存在,不宜混為一談。
2、種屬特異性:
同種蛋白不同物種,有著或大或小的差異。目前大部分商品化抗體都是以人源蛋白序列為模板重組蛋白或規(guī)劃多肽抗原的,根據(jù)蛋白的同源性狀況與其他種屬發(fā)生穿插反應(yīng)。需求參照說(shuō)明書(shū)注明的可反應(yīng)種屬信息。
一些稀有種屬很難找到抗體,可以經(jīng)過(guò)蛋白的序列比對(duì),挑選同源序列免疫的抗體,不過(guò)一般這種狀況生產(chǎn)商不會(huì)受理其關(guān)于質(zhì)量的申述,假如可以申請(qǐng)到免費(fèi)的抗體樣品,則利于抗體挑選。。
3、符號(hào)物的特異性
一般基于試驗(yàn)操作的試驗(yàn)方法不會(huì)運(yùn)用帶有符號(hào)的一抗,比方WB、IHC等,都是經(jīng)過(guò)二抗類的試劑符號(hào)達(dá)到成果出現(xiàn)的意圖。可是基于儀器剖析的一些試驗(yàn),或許就會(huì)運(yùn)用到直接符號(hào)的一抗,比方流式試驗(yàn)。那么需求了解到自己將要運(yùn)用的儀器能檢測(cè)到的熒光規(guī)模,針對(duì)不通的參數(shù)要求挑選對(duì)應(yīng)的符號(hào)物。在免疫熒光雙標(biāo)試驗(yàn)中,需求選配不同的熒光符號(hào)物。
二、抗體種屬來(lái)歷的挑選:
有人以為單抗比多抗好,其實(shí)這并不是一個(gè)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)挠^點(diǎn),只能說(shuō)在或許性上單抗的特異性更好一些,而多抗的親和力會(huì)優(yōu)于單抗,而且特異性并不一定就遜于單抗,首要看抗原的規(guī)劃水平。
目前商品化抗體里單抗首要是鼠單抗、兔單抗,多抗首要是兔多抗、山羊多抗等,其他種屬來(lái)歷抗體較少。不主張糾結(jié)于單抗好還是多抗好,能做出試驗(yàn)的抗體便是好抗體。
在挑選上一般主張?jiān)囼?yàn)種屬和抗體種屬親緣性越遠(yuǎn)越好,不宜同源??贵w不同種屬會(huì)要影響接下來(lái)二抗的選配。特別是在免疫熒光雙標(biāo)試驗(yàn)中,需求在差異于試驗(yàn)種屬的基礎(chǔ)上,區(qū)分開(kāi)兩個(gè)目標(biāo)的抗體種屬來(lái)歷,以便于二抗差異識(shí)別。
三、關(guān)于品牌的挑選:
由于抗體品質(zhì)的異質(zhì)化,關(guān)于抗體的品牌挑選就被我們所注重,可是不管是什么品牌都難免會(huì)遇到不合適自己試驗(yàn)的抗體。所以一般主張考慮那些業(yè)界普遍認(rèn)可、購(gòu)買方便、專業(yè)、售后處理快捷的品牌。
一些乃至都沒(méi)有正式代理的,只能備選。一起購(gòu)買時(shí)一定要找可以供給產(chǎn)品指導(dǎo)、試驗(yàn)剖析、售后處理的正規(guī)代理商購(gòu)買,防止由于買到假貨水貨影響試驗(yàn)。
其實(shí)或許只是生產(chǎn)商只檢測(cè)時(shí)運(yùn)用了不同的種屬不同的樣品類型,或是參照了不同的文獻(xiàn),對(duì)運(yùn)用者來(lái)說(shuō),相同的樣品,不管運(yùn)用哪個(gè)品牌的,只需抗體是對(duì)的,意圖條帶只會(huì)出現(xiàn)在相同的位置。
ELISA試劑盒技術(shù)流程
雙抗體夾心法(檢測(cè)未知抗原) | 間接法(檢測(cè)未知抗體) |
1、用緩沖液將抗體稀釋至1-10ug/ml。在反應(yīng)孔中加0.1ml,4℃ 過(guò)夜。次日,棄去孔內(nèi)溶液,用洗滌緩沖液洗3次。 2、加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.05ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃ 孵育1小時(shí)。然后洗滌(同時(shí)做空白孔,陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔)。 3、加酶標(biāo)抗體:于各反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.05ml。37℃ 孵育0.5~1小時(shí),洗滌。 4、加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃ 10~30分鐘。 5、終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml 6、結(jié)果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,陽(yáng)性程度越強(qiáng),陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺,依據(jù)所呈顏色的深淺,以“+"、“-"號(hào)表示。也可測(cè)OD值:在ELISA檢測(cè)儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值,若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍,即為陽(yáng)性。 | 1、用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1-10ug/ml, 每孔加0.1ml,4℃過(guò)夜。次日洗滌3次。 2、加樣:加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.05ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌。(同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照) 3、加酶標(biāo)抗體:于反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.05ml,37℃孵育30-60分鐘,洗滌,最后一遍用DDW洗滌。 4、加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃ 10~30分鐘。 5、終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml 6、結(jié)果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,陽(yáng)性程度越強(qiáng),陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺,依據(jù)所呈顏色的深淺,以“+"、“-"號(hào)表示。也可測(cè)OD值:在ELISA檢測(cè)儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值,若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍,即為陽(yáng)性。 |
技術(shù)提示:
1、混合蛋白溶液時(shí),避免起泡。
2、加校準(zhǔn)品與樣本時(shí),每個(gè)校準(zhǔn)品濃度和樣本都要更換移液槍頭,公共組分應(yīng)該懸臂加樣,避免交叉污染。
3、合適的溫育時(shí)間,和充分的洗滌步驟,是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的必要條件。
4、底物溶液為無(wú)色液體,保存過(guò)程中變?yōu)樗{(lán)色,代表底物溶液已經(jīng)失效,不得使用。
5、終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致,加入終止液后,藍(lán)色底物產(chǎn)物,會(huì)瞬間變?yōu)辄S色。
6、實(shí)驗(yàn)中,用剩的板條,應(yīng)立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。
7、所有液體組分,使用前充分搖勻,嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)標(biāo)明的時(shí)間、加樣量及加樣順序進(jìn)行溫育操作。
8、檢測(cè)必須符合實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范的規(guī)定,嚴(yán)格防止交叉污染,所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應(yīng)按照傳染物進(jìn)行處置。
試劑盒性能:
1. 樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上。
2. 批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應(yīng)分別小于10%和15% 。
操作注意事項(xiàng)
1)試劑應(yīng)按標(biāo)簽說(shuō)明書(shū)儲(chǔ)存,使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過(guò)后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄,不可保存。
2)實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質(zhì)。
3)不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
4)使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時(shí),避免使用帶金屬部分的加樣器。
5)使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6)洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。
7)底物A應(yīng)揮發(fā),避免長(zhǎng)時(shí)間打開(kāi)蓋子。底物B對(duì)光敏感,避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。
8)加入試劑的順序應(yīng)一致,以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。
9)按照說(shuō)明書(shū)中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。
試劑盒試劑的準(zhǔn)備
1)標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實(shí)驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備,不能儲(chǔ)存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。
2)洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋。
試劑盒操作步驟
1)使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,以免加樣時(shí)加入大量的氣泡,產(chǎn)生加樣上的誤差。
2)根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來(lái)定,能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1:1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。
3)加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的標(biāo)記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育1小時(shí)。
4)甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
5)每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。
6)甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
7)每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10分鐘。避免光照。
8)取出酶標(biāo)板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。
9)在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。
結(jié)果判斷與分析
1、儀器值:于波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)(Y),相應(yīng)的待測(cè)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X),做得相應(yīng)的曲線,樣品的待測(cè)物質(zhì)含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。
本試劑供研究使用
本試劑盒可用于測(cè)定血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液等
自備材料
1)蒸餾水。
2)加樣器:5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3)振蕩器及磁力攪拌器等。
1)避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體,請(qǐng)盡快用水沖洗。
2)實(shí)驗(yàn)中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3)不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。
試劑盒組成 | 48孔配置 | 96孔配置 | 保存 |
說(shuō)明書(shū) | 1份 | 1份 | |
封板膜 | 2片 | 2片 | |
密封袋 | 1個(gè) | 1個(gè) | |
酶標(biāo)包被板 | 1×48 | 1×96 | 2-8℃保存 |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 0.3ml×6管 | 0.3ml×6管 | 2-8℃保存 |
酶標(biāo)試劑 | 5 ml×1瓶 | 10 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
樣品稀釋液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑A液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑B液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
終止液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
20×濃縮洗滌液 | 15ml×1瓶 | 25ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心。
2. 血漿:應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過(guò)程中如有沉淀形成,應(yīng)該再次離心。
3. 尿液:用無(wú)菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過(guò)程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清:檢測(cè)分泌性的成份時(shí),用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融,以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。
5. 組織標(biāo)本:切割標(biāo)本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè),其余冷凍備用。
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn),可將標(biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的(HRP)活性。
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的加樣:設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL。
2. 加樣:分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測(cè)樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻。
3. 加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑100μl,空白孔除外。
4. 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。
5. 配液:將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
6. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。
7. 顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘。
8. 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。
9. 測(cè)定:以空白孔調(diào)零,450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
計(jì)算:
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。
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