豚鼠內(nèi)皮素1(ET-1) ELISA 試劑盒

用途

       ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，

酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。

用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。

此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，

故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。然而，影響Elisa試驗(yàn)結(jié)果的因素很多，故加強(qiáng)各個環(huán)節(jié)的質(zhì)量保證才能充分發(fā)揮其方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn)。

ELISA的評估

ELISA Kit的多指標(biāo)決定了產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣，優(yōu)秀的試劑盒需要對如下6大項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測定評估，分析如下：

1、準(zhǔn)確性

ELISA Kit的多指標(biāo)決定了產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣，優(yōu)秀的試劑盒需要對如下6大項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測定評估，分析如下：

a.回收率：測定試劑盒對數(shù)據(jù)真實(shí)性的校準(zhǔn)，過高或偏低會產(chǎn)生加樣和假性性的失準(zhǔn)數(shù)據(jù)。
b.線性：測定試劑盒稀釋液與樣本微環(huán)境的的準(zhǔn)確性，過高或偏低均會出現(xiàn)測定的偏差。

2、精確度

a.板內(nèi)精確度：評價單次實(shí)驗(yàn)中，同一個已知濃度不同復(fù)孔的差異。
b.板間精確度：評價同一樣本，多次實(shí)驗(yàn)的差異。

3、精密度

檢測限：能顯著區(qū)分空白信號的最小信號值對應(yīng)的濃度，用于評估試劑盒的靈敏度，值越低試劑盒靈敏度越高。

4、特異性

a.交叉反應(yīng)：評判特異性，不同分子與試劑盒抗體結(jié)合能力，交叉反應(yīng)越大，特異性越差。
b.抗干擾能力：同源物的干擾，內(nèi)源性物質(zhì)對檢測系統(tǒng)的干擾。

5.天然樣本檢測性

對天然樣本及合適的樣本類型檢測分析。對天然樣本類型確定，避免假陽性或假陰性結(jié)果。

6、穩(wěn)定性

試劑盒時效性和穩(wěn)定性是對指標(biāo)檢測的重要保障。穩(wěn)定性越高，試劑盒存儲時間越久。

ELISA的原理

ELISA原理是將抗原或抗體包被在固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合，檢測過程中，通常使用洗板的方式去除非結(jié)合物，最終酶促反應(yīng)后的底物的顏色，對樣本中蛋白進(jìn)行定性與定量。

不按說明書操作會造成的后果

每一個試劑盒里都會有對應(yīng)的說明書，注意事項(xiàng)里大多都會提到“實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行"。為什么要嚴(yán)格按照說明書操作？為了更完整的回答這個問題，需要先回顧一下ELISA各種方法的原理。

根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀及檢測的具體條件，可設(shè)計(jì)出不同類型的檢測方法。大致分為以下幾類：

1.雙抗體夾心法測抗原

2.雙抗原夾心法測抗體

3.競爭法測抗原

4.間接法測抗體

總結(jié)如果不按說明書操作可能會出現(xiàn)的不滿意結(jié)果。

A. 先說最嚴(yán)重的操作錯誤，看錯或壓根不看試劑盒配套說明書，不按操作步驟加樣。比如把競爭法的試劑盒當(dāng)作雙抗體夾心法來做，導(dǎo)致的結(jié)果就是整板顯示很強(qiáng)的藍(lán)色，無任何梯度。

B. 混用別的試劑盒里的試劑。不同廠家或者相同廠家的不同試劑盒，所含的試劑成分很可能是不一樣的，混用導(dǎo)致的結(jié)果是，浪費(fèi)珍貴的樣本，樣品的回收率達(dá)不到預(yù)期值，如果混用不同試劑盒的酶復(fù)合物，會導(dǎo)致顯色過弱或過強(qiáng)，因?yàn)槊糠N試劑盒所用酶復(fù)合物效價可能不一樣。

C. 不看文獻(xiàn)或者不做預(yù)實(shí)驗(yàn)。比如某個試劑盒按照其靈敏度范圍和文獻(xiàn)報(bào)道推算樣本應(yīng)該1:10稀釋，結(jié)果稀釋成1:1000，導(dǎo)致的結(jié)果是顯色過弱，結(jié)果不可用。

D. 不校準(zhǔn)移液器及培養(yǎng)箱的溫度濕度。導(dǎo)致工作試劑濃度不準(zhǔn)確，孵育溫度不合適，實(shí)驗(yàn)帶來誤差。

E. 洗滌不充分，每孔洗液加樣過少，或者殘留。導(dǎo)致的結(jié)果是顯色過快，同時背景較高。

F. 手洗板時所用槍頭沒有懸空加入洗液，導(dǎo)致洗液污染，整個實(shí)驗(yàn)失敗。

G. 剩余酶標(biāo)板條未及時放入干燥袋，導(dǎo)致酶標(biāo)板受潮，下一次再做時，顯色過弱或污染，CV值過高。

 ELISA常見主要試劑

1. 抗體：單抗特異性強(qiáng)，多抗結(jié)合性高，試劑盒需要高效的配對。

2. 2.抗原：大多為重組蛋白,細(xì)胞因子和待測樣本，高效標(biāo)準(zhǔn)品需NIBSC/WHO校準(zhǔn)。

3. 3.顯色作用體系：首先辣根過氧化物酶（HRP）與常見底物TMB和OPD均可形成顯色體系，再者堿性磷酸酶(AP)的底物為對-磷酸酯可形成黃色底物，還有葡萄糖氧化酶（GOD）的葡萄糖氧化酶法形成特殊顯色，最后β-D-半乳糖苷（β-D-Gal）的底物為4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）可生成高強(qiáng)度熒光。

ELISA試劑盒采樣的準(zhǔn)備保證和運(yùn)輸要求
采樣ELISA試劑盒準(zhǔn)備包裝和運(yùn)輸要求：
1）準(zhǔn)備無菌容器、樣品標(biāo)簽、采樣登記表、記號筆、樣品運(yùn)輸過程中所需物品(如包裝箱、冷藏設(shè)備)等。
2）采集樣品的在樣品采集、運(yùn)輸、儲存等過程中，應(yīng)采取必要的措施防止交叉污染和環(huán)境污染及食品中微生物的數(shù)量和生長能力發(fā)生變化。
3）樣品應(yīng)在接近原有儲存溫度的條件下傳送，冷凍、冷藏的樣品應(yīng)能達(dá)到規(guī)定溫度，樣品送到實(shí)驗(yàn)室應(yīng)越快越好，如果路途遙遠(yuǎn)，應(yīng)將不需冷凍的樣品都保存在2℃-5℃環(huán)境中；
4）冷凍產(chǎn)品可以冷凍運(yùn)輸或者在允許解凍的情況下冷藏運(yùn)輸，但樣品溫度不得超過 8℃，一旦解凍不得再次冷凍，保持冷卻即可。
ELISA試劑盒為了更好的服務(wù)好每一位顧客，始終把產(chǎn)品品質(zhì)和人力資源視為企業(yè)發(fā)展的原動力，“崇尚品質(zhì)，以人為本"，堅(jiān)決抵制低劣、偽冒產(chǎn)品的不正當(dāng)競爭。
在注重產(chǎn)品品質(zhì)和人才隊(duì)伍的同時也建立了一套、物流、售后服務(wù)等服務(wù)體系，為您提供快速穩(wěn)定的供應(yīng)、無可挑剔的質(zhì)量、貼心的服務(wù)。

如何保持胚胎干細(xì)胞的無線潛能

      胚胎干細(xì)胞（ESCs）具有的潛能，其可以轉(zhuǎn)化成為機(jī)體任何一種類型的細(xì)胞，一旦其開端沿著某一特定的途徑轉(zhuǎn)化成為某種特定的安排，胚胎干細(xì)胞就會失掉無限的潛能，如今科學(xué)家們嘗試了解這一進(jìn)程發(fā)作的方法和原因，旨在開發(fā)新型再生療法，即誘導(dǎo)機(jī)體本身的細(xì)胞替代受損或疾病的器官。

     近日，一項(xiàng)刊登在國際雜志Nature Communications上的研討報(bào)告中，來自索爾克研討所的科學(xué)家們經(jīng)過研討開發(fā)了一種新型蛋白復(fù)合體，其能按捺干細(xì)胞的發(fā)展，從而使其可以保持無限的潛能；這種名為GBAF的復(fù)合體或有望作為后期科學(xué)家們開發(fā)新型再生醫(yī)學(xué)療法的潛在靶點(diǎn)。

     研討者Diana Hargreaves教授表明，這項(xiàng)研討中，咱們始于對胚胎干細(xì)胞多能性的探究，這種多能性可以促進(jìn)胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為機(jī)體中任何一種類型的細(xì)胞，闡明控制干細(xì)胞多潛能性的多種基因網(wǎng)絡(luò)十分重要，因而可以找到一種在這一調(diào)節(jié)進(jìn)程中扮演關(guān)鍵角色的不知道蛋白，關(guān)于研討者而言也是十分有意義的。機(jī)體中的每一個細(xì)胞都有著相同的一套DNA元件，其包括有制作每一種可能性細(xì)胞類型的指令；大型的蛋白復(fù)合體（染色質(zhì)重塑器）可以激活或沉默基因的表達(dá)，輔導(dǎo)胚胎干細(xì)胞進(jìn)入到一種特殊的途徑中，就比如一群計(jì)劃裝修房子的承包商們，這些蛋復(fù)合體也包括有多重亞單位，不同亞單位的組合就可以改動DNA的物理形狀，而且決定哪些基因可以指揮干細(xì)胞分解成為肺部細(xì)胞或大腦細(xì)胞。

     文章中，研討人員想經(jīng)過研討深入了解這些亞單位的集合方法以及特殊的亞單位如何指揮蛋白復(fù)合體的功用，因而研討人員轉(zhuǎn)向?qū)σ环N名為BRD9的蛋白進(jìn)行研討，該蛋白與BAF染色質(zhì)重塑器家族有關(guān)，他們估測該蛋白或是其中的一種亞單位；隨后研討者將BRD9化學(xué)按捺劑應(yīng)用于胚胎干細(xì)胞中，并進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)來全面剖析與BAF復(fù)合體活性改動相關(guān)的細(xì)胞多潛能性。
研討者發(fā)現(xiàn)，BRD9能扮演胚胎干細(xì)胞發(fā)育制動器的角色，當(dāng)BRD9開端發(fā)揮作用時，細(xì)胞就會保持多潛能性，而當(dāng)BRD9的活性被按捺時，細(xì)胞就會開端發(fā)育的下一個階段，隨后研討者鑒別出了哪種BAF復(fù)合體能在細(xì)胞中發(fā)揮作用，結(jié)果表明，BRD9或許是一種不知道BAF復(fù)合體的一部分。

豚鼠內(nèi)皮素1(ET-1) ELISA 試劑盒

 2、精確度

a.板內(nèi)精確度：評價單次實(shí)驗(yàn)中，同一個已知濃度不同復(fù)孔的差異。

b.板間精確度：評價同一樣本，多次實(shí)驗(yàn)的差異。

3、精密度

檢測限：能顯著區(qū)分空白信號的最小信號值對應(yīng)的濃度，用于評估試劑盒的靈敏度，值越低試劑盒靈敏度越高。

 4、特異性

a.交叉反應(yīng)：評判特異性，不同分子與試劑盒抗體結(jié)合能力，交叉反應(yīng)越大，特異性越差。

b.抗干擾能力：同源物的干擾，內(nèi)源性物質(zhì)對檢測系統(tǒng)的干擾。

 5.天然樣本檢測性

對天然樣本及合適的樣本類型檢測分析。對天然樣本類型確定，避免假陽性或假陰性結(jié)果。

 6、穩(wěn)定性

試劑盒時效性和穩(wěn)定性是對指標(biāo)檢測的重要保障。穩(wěn)定性越高，試劑盒存儲時間越久。

ELISA的應(yīng)用

ELISA技術(shù)是特定靶標(biāo)蛋白質(zhì)定量的金標(biāo)準(zhǔn)，提供快速，穩(wěn)定且易于分析的結(jié)果?？梢詫ι锎蠓肿?小分子的定量，對親和力測定評價或者篩選，還可對重組蛋白或細(xì)胞因子進(jìn)行活性比對分析等運(yùn)用。常應(yīng)用于細(xì)胞因子，趨化因子，生長因子等檢測，同時應(yīng)用于癌癥、干細(xì)胞、免疫學(xué)、神經(jīng)學(xué)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等研究領(lǐng)域的靶標(biāo)。

ELISA實(shí)驗(yàn)所用試劑-酶的底物與最后步驟詳解介紹！

1，酶的底物

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HRP的底物

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HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng)，代表性的過氧化物為H2O2，其反應(yīng)式如下：DH2+ H2O2 D+ H2O

　　上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測定。常用的供氫體有(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。

　OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物的底物。OPD本身難溶于水，OPD·2HCL為水溶性。曾有報(bào)道OPD有致異變性，操作時應(yīng)予注意。OPD見光易變質(zhì)，與過氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時用蒸餾水稀釋。先進(jìn)的ELISA試劑盒中則直接配成含保護(hù)劑的工作濃度為0.02% H2O2的應(yīng)用液,只需加入OPD后即可作為底物應(yīng)用液。

　　TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色，目視對比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無致癌性等優(yōu)點(diǎn)，因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反應(yīng)用HCL或終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長為405nm。

ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。

　　另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，經(jīng)HRP作用后，產(chǎn)物顯熒光，可用熒光光度計(jì)測量。用于ELISA的優(yōu)點(diǎn)為可加寬定量測定的線性范圍。

　　HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。H2O2應(yīng)用最多，但尿素過氧化物為固體，作為試劑較H2O2方便、穩(wěn)定。試劑盒供應(yīng)尿素過氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉、低溫（2～8℃）可穩(wěn)定1年。

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AP的底物

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　　AP為磷酸酯酶，一般采用對磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-作為底物，可制成片劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。

2，洗滌液

　　在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。

3，　酶反應(yīng)終止液

　　常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。

4，陽性對照品和陰性對照品

　　陽性對照品(positive control)和陰性對照品(negative control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時也作為判斷結(jié)果的對照，因此對照品，特別是陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致。以人血清為標(biāo)本的測定，對照品最好也為人血清，因?yàn)檎Ｈ搜逶诟鞣NELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。由于大量正常人血甭較難得到，國外試劑盒中的對照品多以復(fù)鈣人血漿(recalcified human plasma)為原料，即在血漿中加入鈣離子，使其中的纖維蛋白質(zhì)凝固，除去凝塊后所得的液體，其組成與血清相似。陰性對照品須先行檢測，確定其中不含待測物質(zhì)。

例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。陽性對照品多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)，其中加入一定量的待檢物質(zhì)，此量最好在試劑說明書中標(biāo)明。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱，在測定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可對標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有一個粗略的估計(jì)。國外檢測HBsAg的ELISA試劑盒檢測敏感度約為0.5ng/ml，陽性對照品中含量約為10ng/ml。在對照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。

5，參考標(biāo)準(zhǔn)品

　　定量測定的ELISA試劑盒（例如甲胎蛋白質(zhì)癌胚抗原測定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中。